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用clontech的试剂盒做的3'race反转结果有问题

2016-09-14技术资料

用clontech的试剂盒做的3'race反转,一共做了两个基因,做了一次nest pcr,得到比较单一的条带(600bp左右,kodplus 回收加A),回收连18t测序摇菌测序。其中一个基因A,三个克隆的序列都是一致的,和NCBI的DNA序列也是一样;另一个基因B就有点古怪了,菌液PCR结果有部分条带比回收带小的,当时取了5个测序(3个正常带,2个较小的条带),2个较小的带靠近GSP区200bp是目的序列,后面是来自另一条染色体的序列,3个正常的带结果还算正常,只是它们长度不同。而且有两个疑问:
1、多出来的序列在基因组中能够匹配,但是polyA之前的第一个序列与基因组不匹配,如C应该为T,排除测序问题,送了两个公司测,不同的克隆。
2、根据clontech的引物说明,反转用的引物序列如下所示,polyA有30个,两个基因都没有这么多,A有24个,B的两个测序产物只有14和13,不知道为什么会这样,求解。
3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 V N–3'
(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C)
附3’引物混合物序列:
10X Universal Primer A Mix (UPM)
Long (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Short (2 µM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3

用户评论

rioarsenal:

福建快3计划基因B不是有三个正常的么,直接用就行了。那两个比较小的可以暂时不考虑。另外,我记得invitrogen有个race试剂盒,3’5’可以一起出来,比较好用。

楼主恢复:

嗯,谢谢楼上,觉得很奇怪,是不是没有拿到3‘全长,3个正常带中有两个比较短20个bp,另外这个基因的polyA前面的第一个碱基在基因组中总是不匹配。
另外问个5’问题,用的也是clontech的试剂盒,RNA接头连上后反转,试了takara的几个pcr聚合酶,都没有条带,然后换toyobo的kod酶(做3‘时候发现用takara酶的LA也没有条带,后来用kod才出来),两个基因设计8对引物,其中有条带,但是有杂带。二次出来有两条引物条带很亮,但是测序结果都不对,在引物中间的序列乱七八糟,在blast比对后,发现在基因组中有多拷贝,估计是什么组蛋白之类高丰度的mRNA。把产物稀释后做nested pcr,基本没有条带,是不是排除了酶和引物的问题,是5’race没有做好?

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